Microbiología cínica

Prácticas de microbiología






NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA


• Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.


• Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente cerrada.


• Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica.


• Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes.


• Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura y estando físicamente cómodo.


• Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las áreas de laboratorio.


• Evitar llevar en el laboratorio accesorios que podrían ser fuente de contaminación (por ejemplo joyas).


• Recoger el cabello largo.


PRÁCTICA 1: OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS EN FRESCO
OBJETIVO:
Observar microorganismos en el microscopio.
FUNDAMENTO:
Recoger muestra de agua estancada,ponerla en un porta y verla al microscopio.
MATERIAL Y REACTIVOS:
- Portaobjetos,
-Cubreobjetos,
-Muestra de agua,
-Pipeta Pasteur
-Microscopio.
PROCEDIMIENTO:
1. Coger una muestra de agua estancada con una pipeta Pasteur y guardarla en un frasco.
2. Remover el frasco antes de coger la muestra.
3. Abrir el frasco y coger una gota de la muestra con una pipeta Pasteur y ponerla en un portaobjetos.
4. Poner un cubreobjetos encima de la gota y verla al microscopio.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Se observaron microorganismos en movimiento.
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD:
  • Coger la muestra siempre con los guantes puestos.
  • Lavarse las manos después de la práctica.

PRÁCTICA 2: TOMA DE MUESTRA DE BIOTA CORPORAL
OBJETIVO:
Identificar bacterias en el microscopio de alguna parte de nuestro cuerpo.
FUNDAMENTO:
Visualizar en el microscopio bacterias de un área de nuestro organismo, en este caso del antebrazo y observar los resultados.
MATERIAL Y REACTIVOS:
-Mechero Bunsen
-Tijeras
-Hisopo
-Tubo con agua de peptona
-Gradilla
PROCEDIMIENTO:
1. Se coge el hisopo y se pasa por el antebrazo que queramos.
2. Se echa el hisopo en el tubo de agua de peptona calentando la boca de este antes y después se corta la parte sobrante con unas tijeras.
3. Cuando se abre el tubo, volver a calentar la boca con el mechero Bunsen para evitar la contaminación de la muestra.
4. Cerrar el tubo e incubar a 37ºC durante 24 horas y ver los resultados.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: El resultado fue la correcta proliferación de los microorganismos.
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD:
-Antes de sembrar, rotular y ponerle la fecha al tubo.
-Al quitar el tapón del tubo con agua de peptona siempre dejarlo con la boca hacia arriba para no contaminar la muestra.




















PRÁCTICA 3: TINCIÓN VITAL

OBJETIVO:

Observar las bacterias y microorganismos de una muestra y su movilidad con mayor contraste.
FUNDAMENTO:
Coger muestra del tubo de agua de peptona y teñir para ver al microscopio las bacterias y microorganismos de dicha muestra.
MATERIAL Y REACTIVOS:
-Mechero Bunsen
-Gradilla
-Tubos de ensayo
-Safranina
-Rojo metilo
-Portaobjetos
-Cubreobjetos
-Muestra en tubo de agua de peptona
-Micropipeta
-Puntas de micropipeta
-Microscopio.
PROCEDIMIENTO:
1. Preparar las diluciones en dos tubos de ensayo. Una dilución 1:1000 de Safranina y una dilución 1:1000 de rojo de metilo.
2. Cogemos una gota de la muestra del tubo de agua de peptona y le calentamos la boca al abrirlo para que no se contamine.
3. Ponemos la gota en el porta, añadimos una gota de colorante, le ponemos un cubreobjetos encima y vemos los resultados al microscopio.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
No conseguí visualizar nada.
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD:
  • Emplear siempre los EPI




















PRÁCTICA 4: TINCIÓN DIFERENCIAL GRAM
OBJETIVO:
Diferenciar con el microscopio bacterias gram positivas (azul) y gram negativas (rosa) del área del antebrazo.
FUNDAMENTO: Se hace un frotis con bacterias. Se usa un colorante primario catiónico al que se añade un mordiente (Lugol) y después se decolora con alcohol 30%-70% (las gram + retienen el colorante primario) y se añade el colorante de color rojo (Safranina) que teñirá las bacterias gram -
MATERIAL Y REACTIVOS:
-Cristal violeta
-Lugol
-Alcohol
-Safranina
-Pipeta Pasteur
-Portaobjeto
-Mechero Bunsen
-Agua destilada
-Suero fisiológico
-Vaso precipitado
-Microscopio  
-Cubeta.
PROCEDIMIENTO:
1. Se deposita una gota de suero en el portaobjetos, hacemos el frotis y secamos con el mechero Bunsen.
2. Echar el cristal violeta en el porta y esperar 1 minuto.
3. Lavar con agua destilada.
4. Añadir lugol y dejarlo actuar 30 segundos.
5. Lavar con agua destilada.
6. Añadir alcohol 30 segundos.
7. Volver a lavar con agua destilada.
8. Echar la safranina y dejarlo actuar durante 2 minutos.
9. Lavar con agua destilada y dejarlo secar.
10. Echar una gota de aceite de inmersión, poner el microscopio con objetivo 100x y observar los resultados.


INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Como observamos en la imagen conseguimos visualizar estreptobacilos, diplobacilos y empalizadas gram-
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD:
  • Medir bien los tiempos para la tinción
  • No dejar secar mucho tiempo el porta en el bunsen debido a que se puede romper

PRÁCTICA 5: TINCIÓN DE ESPORAS

OBJETIVO:

Visualizar las esporas de las bacterias.
FUNDAMENTO:
Esta tinción se emplea para comprobar si hay esporas en las bacterias. Las bacterias se van a teñir de rosa y sin embargo las esporas se teñirán de color verde.
Si las bacterias han esporulado, las esporas van a estar fuera de ellas denominándose exosporas.
Si vemos dentro de la bacteria el color verde se denominará endospora.


MATERIAL Y REACTIVOS:
-Papel de filtro
-Portaobjetos
-Asa de siembra
-Mechero Bunsen
-Mechero
-Gradilla
-Cristalizador
-Puente de tinción
-Pipeta Pasteur
-Frasco lavador
-Torunda
-Vaso precipitado
-Microscopio
-Aceite de inmersión
-Rotulador permanente
-Suero salino
-Alcohol
-Verde malaquita
-Safranina  
-Muestra de resiembra
PROCEDIMIENTO:
1. Preparación del material .
2. Encender el mechero Bunsen antes de empezar con la práctica.
3. Coger un portaobjetos y poner una gota de suero salino en el centro. Esterilizar el asa de siembra por flameado. Abrir el tubo de ensayo, esterilizar la boca del tubo en la llama del mechero, antes de tomar un poco de muestra del tubo de ensayo, tomar un poco de muestra, esterilizar el tubo por flameado, cerrar el tubo y dejarlo en la gradilla.


4. Poner la muestra en el portaobjetos restregandola por el porta. Esterilizar el asa de siembra por flameado y dejarla en la gradilla.
5. Fijar la muestra por calor con el mechero Bunsen. Después apagar el mechero Bunsen.
6. Poner la muestra en el puente de tinción y preparar las tinciones.
7. Aplicar verde malaquita sobre la muestra con una pipeta Pasteur cubriendola por completo. Llenar un vaso de precipitado con alcohol, impregnar la torunda y encenderla (sin gotear alcohol y sin estar al lado del vaso con alcohol). Aplicar calor a la muestra con la torunda, cuando veamos salir vapor dejar de aplicar calor, si vemos que se evapora el colorante, volver a rellenar con el colorante. Dejar actuar 5 minutos.
8. Escurrir la muestra y aclarar con agua destilada sin presionar la muestra.
9. Aplicar safranina sobre la muestra durante 1 minuto y lavar la muestra con agua destilada.
10. Dejar secar al aire.
11. Visualizar al microscopio óptico con el objetivo de 100x.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Como se ve en la imagen de la izquierda podemos observar muchas exoesporas y bacilos en cadena e incluso algunos diplobacilos.
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD:
  • No hablar a la hora de coger muestra de la placa de petri
  • Tener cuidado al impregnar la torunda en alcohol evitando goteos y acercamientos al vaso que contiene alcohol.



PRÁCTICA 6: Preparación de medios de cultivo
OBJETIVO:
Preparar medios de cultivo en tubo y en placa.
FUNDAMENTO:
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían de unas a otras. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales  y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
​
MATERIAL Y REACTIVOS:
-Agar-Agar
-Autoclave
-Placas de Petri
-Mechero Bunsen
-Balanza
-Matraz Erlenmeyer
-Probeta
-Microondas
-Gradillas
-Tubos
-Cabina de seguridad
-Rotulador
-Espátula
-Vidrio de reloj
-Triptona soja
-Agar nutritivo
-Frascos.
PROCEDIMIENTO:
  1. Preparar el agar-agar. Pesar la agarosa y mezclar el volumen en la probeta y ponerlo en un matraz Erlenmeyer.
  2. Disolver completamente y meter en el microondas.
  3. Para el medio líquido pasamos la agarosa a tubo con tapones y para el medio sólido en placas de Petri (matraz).
  4. Con una pipeta cogemos del Erlenmeyer y llenamos los tubos
  5. Llevar a la autoclave (15 minutos).
​
CÁLCULOS:
30 tubos                                              40g---------1000mL
40g---------1000mL                                X----------- 300mL X= 12g
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:
Los resultados salieron correctamente. El único problema que tuvimos que al dejar enfriarse el medio se formó una bola pero calentandolo de nuevo se fue.
COMPOSICIÓN Y USO DE LOS MEDIOS:
Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:
1.    Indispensables: Entre  primeros se incluye el agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)
2.    Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.
-Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de composición muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios sólidos, semisólidos y líquidos.
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD:
-Meter los frascos en el microondas con la rosca medio abierta.

















PRÁCTICA 7: Técnica de siembra por agotamiento en estría

OBJETIVO:
Realizar la siembra de muestras microbianas para conseguir el aislamiento de bacterias en cultivos primarios.
FUNDAMENTO:
Esta técnica se basa en descargar totalmente el inóculo cargado en un asa de siembra (agotamiento de asa) a lo largo de toda la superficie del medio, de manera que la concentración de muestra en distintas zonas de la placa va disminuyendo a medida que se va agotando el material del asa. Así, tras la incubación, en la misma placa habrá zonas con distinta densidad de crecimiento.
MATERIALES Y REACTIVOS:
  • Papel de filtro.
  • Portaobjetos.
  • Asa de siembra.
  • Mechero Bunsen.
  • Mechero.
  • Gradilla.
  • Rotulador.
  • Placa Petri en medio sólido.
  • Muestra del antebrazo
PROCEDIMIENTO:
  1. Calentar el asa de siembra para esterilizarla.
  2. Abrir el tubo y esterilizar su borde con ayuda del mechero Bunsen.
  3. Coger del fondo del tubo muestra con el asa, esterilizar el tubo y cerrarlo.
  4. Abrir la placa y hacer una estría. De esta forma hasta cuatro veces y cada vez calentar el asa, enfriar en el borde de la placa y hacer la estría.
  5. Cerrar la placa y esterilizar el asa.
  6. Incubar durante 24 horas a 37ºC.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS: Se observan poblaciones de bacterias.
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD:
  • En cada estría, al esterilizar el asa, cerrar la placa para evitar contaminación.
  • Cuando trabajamos con microorganismos evitamos hablar durante las siembras.





Práctica 8 Recuento de UFC en orina
Objetivo: Determinación del número de bacterias presentes en una determinada cantidad de muestra en dos pacientes mediante un urocultivo.
Fundamento: Se realiza un recuento de las bacterias tras incubarlas 24-48 horas con una cantidad de muestra específica (10 microL y 1 microL)
Materiales:
  • Asa desechable de 1 microlitro
  • Papel de filtro
  • Vaso precipitado para desechos
  • Placas de Petri (Chromagar ori ,Cled, Hektoen y  MacConkey)
  • Agua de peptona
  • Citrato de Simmons
  • RHVP
  • Asa de siembra
  • Mechero Bunsen
  • Gradilla
  • Rotulador
  • Tubo de ensayo
  • Portaobjetos
  • Microscopio
  • Muestra de orina del paciente 2 y muestra de orina del paciente 5.
  • Asa desechable de 10 microlitros
​Procedimiento:


1 Realizar una siembra con el asa de 1 microlitro y 10 microlitros en placas distintas
2 La siembra se realiza haciendo una línea recta hasta el medio de la placa. Después hacer una estría desde el comienzo de la línea hasta el medio ocupando la mitad de la placa. Por último realizar otra estría ocupando la otra mitad de la placa.
3 Incubar la placa 24-48 horas y realizar recuento.
Resultados:
En el paciente 2 el resultado fue 174000 UFC/ml y en el paciente 5 no pudimos realizar el recuento porque había un gran número de bacterias.
Precauciones:


  • Realizar la siembra en medio estéril
  • Etiquetar todo adecuadamente















Práctica 9 Prueba de la catalasa
Objetivo: Determinar si la bacteria tiene la enzima catalasa
Fundamento: Observar si hay burbujas (O2) en un tubo con peroxido de hidrogeno tras meter un asa de siembra con muestra bacteriana.
Materiales:
  • Mechero Bunsen
  • Asa de siembra
  • Muestra con bacterias
  • Gradilla
  • Rotulador
  • Vaso de precipitado
  • Agua oxigenada
  • Tubo de ensayo


1 En condiciones de esterilidad coger muestra con asa de siembra de la placa perteneciente al paciente 2
2 Introducir el asa en el tubo con agua oxigenada
3 Observar si se producen burbujas o no.
Resultados:
La muestra del paciente 2 da positivo en catalasa y a la muestra del  paciente 5 no le realizamos dicha prueba porque es gramnegativa
Precauciones:
  • Etiquetar todo correctamente
  • Realizar la práctica en condiciones de esterilidad





























Práctica 10 Prueba de la coagulasa
Objetivo: Determinar si la bacteria posee la enzima coagulasa
Fundamento: Observar si la muestra introducida en un poco de plasma tiene capacidad de coagular a 37ºC durante 4 horas


Materiales:
  • Mechero Bunsen
  • Rotulador
  • Tubos de hemólisis
  • Muestra del paciente 2
  • Papel de filtro
  • Baño termostático
Procedimiento:
1 Introducir 0.5 ml de plasma en el tubo de hemólisis y una muestra representativa de bacterias.
2 Homogenizar bien la muestra
3 Meter la muestra en el baño termostático a 37ºC
4 Observar cada 30 min si se ha producido coagulación
5 A las 4 horas si no se ha producido coagulación el resultado es negativo
Resultados:
La muestra del paciente 2 fue negativa por lo que podemos considerar que la bacteria es Staphylococcus Epidermidis
Precauciones:
  • Etiquetar todo perfectamente
  • Realizar las pruebas en condiciones de esterilidad
Práctica 11 Prueba de la oxidasa
Objetivo: Determinar si la bacteria tiene la enzima oxidasa
Fundamento: Se emplea un kit comercial en el que se pone en contacto la muestra con un determinado sustrato que cambia de color a azul cuando existe presencia de dicha enzima. Se emplea para diferenciar entre enterobacterias y pseudomonas.
Materiales:
  • Mechero Bunsen
  • Papel de filtro
  • Vaso de precipitado
  • Rotulador
  • Asa de siembra
  • Placa petri vacía
  • P-fenil diamina (oxidase reagent)
  • Muestra paciente 5
Procedimiento:
1 Cortar un trozo de papel de filtro y ponerlo en la placa vacía
2 Poner unas cuantas gotas de reactivo en el papel
3 Con el asa de siembra coger y poner muestra sobre el papel con el reactivo
4 Esperar 15-30 segundos para ver el resultado
Resultados:
La muestra del paciente 5 dio negativa en oxidasa por lo que tiene que ser un tipo de enterobacteria.


A la muestra del paciente 2 no le hicimos esta prueba porque la bacteria del paciente 2 es grampositiva
Precauciones:
  • Etiquetar todo correctamente
  • Mantener las condiciones de esterilidad
  • Procurar que el tiempo de la prueba no pase de 30 segundos para evitar falsos positivos








Práctica 12 Prueba del KIA
Objetivo: Identificar enterobacterias según la capacidad que tienen de fermentar o no glucosa o lactosa. Con esta prueba también se puede observar si la bacteria produce gas y ácido sulfhídrico
Fundamento: Dicha prueba consiste en hacer una siembra en picadura y extensión superficial en medio de cultivo KIA y observar si metabolizan glucosa o lactosa acabo de 48 horas
Materiales:
  • Mechero Bunsen
  • Gradilla
  • Estufa
  • Asa de siembra
  • Muestra del paciente 5
  • Medio de cultivo KIA
Procedimiento:
1 Realizar una siembra en picadura en el medio de cultivo KIA y después realizar seguidamente una extensión superficial
2 La siembra se realiza infiltrando la punta del asa de siembra con la muestra en el KIA y al sacarla sobre la superficie realizamos una estría
3 Metemos el tubo a incubar en la estufa a 37ºC
4 Observar el tubo a las 24 horas y después a las 48 horas


Resultados:
La muestra del paciente 5 fermenta glucosa y lactosa debido a que el tubo quedó entero amarillo tras las dos observaciones.
Dicha prueba se la realizamos a al paciente 5 porque la bacteria es gramnegativa
Precauciones:
  • Etiquetar todo adecuadamente
  • Mantener las condiciones de esterilidad





















Práctica 13 Pruebas IMVIC
Objetivo: Identificación de enterobacterias mediante pruebas combinadas
Fundamento: Consiste en varias pruebas que según los resultados determina si es un tipo de enterobacteria u otra
Materiales:
  • Mechero Bunsen
  • Papel de filtro
  • Tubos de ensayo
  • Asa de siembra
  • Vaso de precipitado para residuos
  • Pipeta Pasteur
  • Muestra del paciente 5
  • Rojo de metilo diluido
  • Alfa-naftol
  • Agar Simmons
  • Agua de peptona
  • MRVP
  • KOH
Procedimientos:
INDOL:
1 Incubar el cultivo en agua de peptona a 37ºC en la estufa durante 24-48 horas
2 Después añadir 5 reactivo de kovacs
3 Ver si se forma un halo rosado o no.


ROJO DE METILO:
1 Incubar la muestra en MRVP a 37ºC en la estufa durante 24-48 horas
2 Mezclar en un tubo de ensayo muestra del MRVP y rojo de metilo (3ml)
3 Agitar y observar los resultados


VOGES PROSKAUER


1 Incubar la muestra en MRVP a 37ºC en la estufa durante 24-48 horas
2 Después añadir 0.5 ml de alfa-naftol y 0.5 ml de KOH al 40%
3 Agitar y poner en horizontal
4 Esperar 15 minutos
5 Poner el tubo en posición vertical y ver el resultado


CITRATO:
1 Incubar la muestra, tras sembrar en agar Simmons, 24-48 horas a 37ºC en la estufa
2 Observar si ha consumido citrato o no.


Resultados:
  • Indol: Positivo por lo que la bacteria posee la enzima triptofanasa
  • Rojo de metilo: Positivo por lo que la bacteria fermenta hidratos de carbono por la vía ácido mixta
  • Voges Proskauer: Negativo por lo que la bacteria no fermenta azúcares por la vía butanolica
  • Citrato: Negativo la coloración no cambio a azul por lo que la bacteria no usa el citrato como fuente de carbono
Según estos resultados la enterobacteria sería Escherichia Coli
Precauciones:
  • Etiquetar todo adecuadamente
  • Mantener las condiciones de esterilidad






























Práctica 14 Prueba de la DNasa
Objetivo: Determinar la actividad desoxirribonucleasa para identificar bacterias
Fundamento: Dicha técnica consiste en sembrar e incubar una muestra en medio de cultivo con ADN y desnaturalizar con HCl para ver si la bacteria a consumido el medio.
Materiales:
  • Mechero Bunsen
  • Medio cultivo DNasa
  • Papel de filtro
  • Muestra del paciente 2
  • Estufa
  • Asa de siembra
  • HCl
  • micropipeta
  • Punta de micropipeta
  • Vaso de precipitado para residuos
Procedimiento:
1 Realizar la siembra en forma de rejilla en mitad de la placa con el medio de cultivo e incubar a 37ºC durante 24-48 horas en la estufa
2 En la cabina de seguridad añadir HCl a la placa y mover para que se extienda bien
3 Observar la formación o no de un halo alrededor de la rejilla
Resultados:
El resultado fue positivo ya que se formó el halo por lo que la bacteria consume ADN. Esto es específico de los Staphylococcus aureus


Precauciones:
  • Etiquetar todo correctamente
  • Mantener las condiciones de esterilidad
  • Cuidado al usar el HCl













Práctica 15 Antibiograma
Objetivo: Determinar antibióticos eficaces contra las bacterias identificadas
Fundamento: En esta prueba añadimos discos de antibióticos en la placa con el césped bacteriano y al cabo de 24-48 horas tras incubar a 37ºC observamos que antibiótico es eficaz
Materiales:
  • Mechero Bunsen
  • Papel de filtro
  • Asa de Digralsky
  • Muestra del paciente 2 y 5
  • Placa con medio de cultivo
  • Discos con antibiótico
  • Pinzas
Procedimiento:
1 Sembrar las muestras haciendo un césped bacteriano con el asa de Digralsky
2 Insertar los discos en el medio de cultivo y separados entre ellos
3 Incubar 24-48 horas a 37ºC en la estufa
4 Observar si hay crecimiento alrededor de los discos o no.
Resultados:
Alrededor de los discos no ha crecido nada por lo que los 5 antibióticos empleados tanto con la muestra 2 que con la 5 son eficaces contra las bacterias. Se puede decir que las bacterias son sensibles dichos antibióticos
Los diámetros de cada halo son los siguientes:
Paciente 2
  • SXT -> 3cm
  • CL -> 1,2cm
  • FOX -> 3,6cm
  • C -> 3,6cm
  • NN -> 1,7cm
Paciente 5
  • CF -> 1,8cm
  • C -> 2,2cm
  • FOX -> 2,8cm
  • GM -> 3,4cm
  • SXT -> 2,8cm





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